RNA-transfektion

Armando Gaskell August 16, 2016 R 0 0
FONT SIZE:
fontsize_dec
fontsize_inc

RNA transfektion er processen med bevidst at indføre RNA i en levende celle. RNA kan oprenses fra celler efter lysering eller syntetiseres fra frie nukleotider enten kemisk eller enzymatisk under anvendelse af en RNA-polymerase til transkribering en DNA-template. Som med DNA, RNA kan administreres til celler ved en række midler, herunder mikroinjektion, elektroporering og lipid-medieret transfektion. Hvis RNA koder for et protein, kan transficerede celler oversætte RNA i det kodede protein. Hvis RNA er en regulerende RNA, kan RNA forårsage andre ændringer i cellen.

Terminologi

RNA-molekyler kortere end ca. 25nt vid udstrækning undgå at blive opdaget af det medfødte immunsystem, som udløses ved længere RNA-molekyler. De fleste celler i kroppen udtrykke proteiner i det medfødte immunsystem, og ved udsættelse for eksogen lange RNA-molekyler disse proteiner igangsætte signalering kaskader, der resulterer i inflammation. Denne inflammation hypersensitizes den eksponerede celler og nærliggende celler til efterfølgende eksponering. Som et resultat, mens en celle kan gentagne transficeret med korte RNA med få ikke-specifikke effekter, gentagne transfektion af celler med selv en lille mængde af lange RNA kan forårsage celledød medmindre der træffes foranstaltninger til at undertrykke eller omgå det medfødte immunsystem.

Short-RNA-transfektion

Short-RNA-transfektion anvendes rutinemæssigt i biologisk forskning at banke ned udtryk for et protein af interesse, eller for at udtrykke eller blokere aktiviteten af ​​et miRNA. Mens DNA-baserede vektorer, som koder for en kort RNA-molekyle kan også anvendes, betyder korte RNA transfektion ikke risikere ændring af cellens DNA, en egenskab, der har ført til udviklingen af ​​korte RNA som en ny klasse af makromolekylære lægemidler.

Lang RNA transfektion

Long-RNA transfektion er processen med bevidst at indføre RNA-molekyler længere end ca. 25nt i levende celler. Der skelnes mellem kort og lang RNA transfektion fordi eksogene lange RNA-molekyler fremkalde et immunrespons medfødt i celler, der kan medføre en række uspecifikke virkninger, herunder oversættelse blok, celle-cyklus anholdelse, og apoptose.

Endogen vs. eksogen lange RNA

Det medfødte immunsystem har udviklet sig til at beskytte mod infektion ved at registrere patogen-associeret molekylære mønstre, og udløser et komplekst sæt af svarene kollektivt kendt som "betændelse". Mange celler udtrykker specifikke mønstergenkendelse receptorer for eksogen RNA herunder toll-like receptor 3,7,8, RNA helicase RIG1, protein kinase R, medlemmer af oligoadenylat syntetase-familien af ​​proteiner og andre. Alle disse proteiner kan specifikt binder til eksogene RNA-molekyler og udløse et immunrespons. Den specifikke kemiske, strukturelle eller andre egenskaber ved lange RNA-molekyler, der kræves for anerkendelse fra PRRS stort set ukendt på trods intens undersøgelse. På ethvert givet tidspunkt, kan en typisk pattedyr celle indeholder flere hundrede tusinde mRNA og andre, regulatoriske lange RNA-molekyler. Hvordan celler skelner eksogen lange RNA fra den store mængde af endogent lange RNA er et vigtigt åbent spørgsmål i cellebiologi. Adskillige rapporter tyder på, at phosphorylering af 5'-enden af ​​en lang RNA-molekyle kan påvirke dets immunogenicitet, og specifikt, at 5'-triphosphat RNA, som kan fremstilles under virusinfektion, er mere immunogene end 5'-diphosphat RNA, 5 ' -monophosphate RNA eller RNA, der ikke indeholder 5'-phosphat. Men in vitro-transkriberet RNA lange indeholdende en 7-methylguanosin cap er også meget immunogent trods nogen 5'-phosphat, hvilket tyder på, at andre end 5'-phosphorylering egenskaber kan påvirke immunogeniciteten af ​​et RNA-molekyle.

Eukaryote mRNA indeholder kemisk modificerede nukleotider, såsom N-methyladenosin, 5-methylcytidin, og 2'-O-methylerede nucleotider. Selv om kun et meget lille antal af disse modificerede nukleotider er til stede i en typisk mRNA-molekyle, kan de hjælpe med at forhindre mRNA fra aktivering af medfødte immunsystem ved at ødelægge sekundær struktur, som ville ligne dobbeltstrenget RNA, en type RNA troede være til stede i celler kun i virusinfektion. Immunogeniciteten af ​​lange RNA har været anvendt til at undersøge både medfødt og adaptiv immunitet.

Gentagen lang RNA transfektion

Inhibering kun tre proteiner, interferon-β, STAT2 og EIF2AK2 er tilstrækkelig til at redde humane fibroblaster fra celledød forårsaget af hyppig transfektion med lange, protein-kodende RNA. Hæmmende interferon signalering forstyrrer den positive-feedback-loop, der normalt hypersensitizes celler udsat for eksogen lange RNA. Forskere har for nylig brugt denne teknik til at udtrykke omprogrammering proteiner i primære humane fibroblaster.

  Like 0   Dislike 0
Forrige artikel Den Lawton Story
Næste artikel Starnberg
Kommentarer (0)
Ingen kommentar

Tilføj en kommentar

smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile smile smile smile smile
smile smile smile smile
Tegn tilbage: 3000
captcha